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Genomica funzionale, iPS cells, exome sequencing: strategia multidisciplinare per la gestione individualizzata delle malattie aritmogene ereditarie

Nonostante i recenti avanzamenti delle tecniche di indagine di genetica, le basi molecolari di diverse malattie aritmogeniche ereditarie ed in particolare quelle derivanti da anomalo funzionamento della regione pacemaker cardiaca o da insorgenza di attività pacemaker ectopica nel miocardio contrattile (Bradicardia Sinusale BS, Sindrome del Seno Malato SSS, Tachicardia Sinusale Inappropriata TSI e Fibrillazione Atriale FA) rimangono ancora in larga parte sconosciute. Questo progetto di Ricerca si propone di investigare le basi genetiche delle aritmie sinusali mediante un approccio interdisciplinare. Il Nodo SenoAtriale (NSA) �? la regione cardiaca da cui origina l’attività autoritmica e il ruolo dei canali ionici “funny” nella generazione del ritmo e modulazione della frequenza cardiaca �? ben noto.
I canali f rappresentano quindi un ovvio target nella ricerca delle cause molecolari delle disfunzioni senoatriali. Recenti ricerche hanno effettivamente identificato specifiche canalopatie derivanti dal alterazioni genetiche dei canali “f”, in supporto dell’ipotesi che modificazioni funzionali di questi canali siano tra le cause principali di aritmie sinusali ereditarie.
Un primo obiettivo del nostro progetto sarà quindi di verifiicare se (e quali) forme specifiche di aritmie sinusali sono associate a difetti genetici dei canali “f”, i canali responsabili della generazione del ritmo, i cui correlati molecolari sono i canali HCN4. Questo obiettivo sarà realizzato con un approccio del tipo “candidate gene” mediante sequenziamento dei geni codificanti HCN4 e proteine modulatorie. Usando questo approccio, il nostro laboratorio ha identificato per la prima volta, in una grande famiglia Italiana con bradicardia sinusale asintomatica, una mutazione di HCN4 la cui modificazione funzionale �? in grado di giustificare pienamente la patologia (Milanesi et al., 2006).
Un secondo obiettivo sarà di usare la tecnologia di sequenziamento di nuova generazione dell’esoma per estendere il range di investigazione dei meccanismi dai base responsabili della malattia in famiglie con fenotipo aritmico ma genotipo negativo per i canali HCN4 e proteine modulatrici. Questo approccio mira a identificare altri canali e proteine strutturali/ancillari la cui alterata funzione può modificare il normale funzionamento fisiologico del NSA.
Studi funzionali verranno poi effettuati sulle mutazioni rilevate con il procollo del gene candidato o con il sequenziamento dell’esoma. Mutazioni di canali ionici (HCN4 e altri) e proteine accessorie saranno studiate nel nostro laboratorio mediante esperimenti di espressione cellulare eterologa (elettrofisiologia con patch-clamp, traffiking di membrana, immunofluorescenza) in cellule HEK293. Questi studi forniranno informazioni di base sulle modifiche indotte dalle mutazioni sulle proprietà funzionali di canali/proteine; la nostra aspettativa �? che queste modifiche correlino con il fenotipo aritmico.
Un terzo obiettivo sarà di generare cardiomiociti a partire da cellule iPS derivate da pazienti. In tutti quei casi in cui la funzione delle proteine mutate non può essere facilmente interpretata come azione sulle caratteristiche elettriche delle cellule del NSA, e quindi le modifiche funzionali indotte dipendono da altri meccanismi e processi cellulari (fattori di trascrizione, proteine strutturali, protein kinasi), noi adotteremo un approccio basato sulla generazione di cellule pacemaker a partire da cellule iPS derivate dai pazienti. Questo ci permetterà di riprodurre un ambiente cellulare simile a quello della reale cellula senoatriale del paziente.
In conclusione, l’obiettivo primario di questo progetto �? di fornire, mediante una combinazione di studi genetici e caratterizzazioni funzionali cellulari, un quadro di riferimento per identificare i difetti genetici alla base di forme ereditarie di aritmie sinusali, e proporre un’interpretazione cellulare/molecolare della malattia.

Principal Investigators:
  • DARIO DI FRANCESCO loading
Financing institution:
MINISTERO DELL'ISTRUZIONE, DELL'UNIVERSITA' E DELLA RICERCA
Type:
PRIN10-11 - PRIN bando 2010-11
Project leader:
UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI PAVIA
Year:
2010
Duration:
36
Status:
Closed
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